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SCRIPT Transcriptase Reversa | Síntese de cDNA - Cellco
Código | SCRIPT Transcriptase Reversa |
Categoria | Síntese de cDNA |
Marca | Cellco |
SCRIPT Transcriptase Reversa | Síntese de cDNA - Cellco
Transcriptase reversa de alta sensitividade e especificidade
For in vitro use only!
Form: liquid
Concentration: 200 units/µl
200 units/µl in 20 mM Tris-HCl , 5 mM DTT, 50% pH 7.5 (25°C) glycerol (v/v) and stabilizers.
Tris-HCl (pH 8.3), KCl, MgCl2 and DTT.
100 mM DTT
Extremely sensitive and highly specific RT-PCR, synthesis of highly structured cDNA fragments, DNA labelling.
Component | Stock conc. | Final conc. | 20 µl assay |
SCRIPT 3.0 RT buffer complete | 5x | 1x | 4 µl |
RNA template1 | - | x µl | |
Primer Fw and Rv2 | 10 µM | 1 - 5 µl | |
SCRIPT 3.0 RT | 200 units/ µl | 100 units | 0,5 µl |
RNAse-free water | - | - | up to 20 µl |
DTT | 100 mM | 5 mM | 1 µl |
RNAse Inhibitor3 (optional) | 40 units / | 40 units | 1 µl |
dNTP mix | 10 mM | 500 µM | 1 µl |
Component | [ Stock ] | [ Final ] | [ Final ] |
RNA template1 | - | 10 pg - 5 µg | x µL |
Primer forward2 | 10 µM | 10 - 50 pmol | 1 - 5 µL |
Primer reverse2 | 10 µM | 10 - 50 pmol | 1 - 2 µl |
RNAse-free water | - | - | up to 10 µl |
1) Total RNA: 10 pg - 5 µg or mRNA: 10 pg - 500 ng
2) Gene specific primer: 10-20 pmol (50-100 ng) - Oligo-dT15-25 primer: 50 pmol ( 300 ng) - Random primer: 50 pmol (100 ng)
Denaturation and primer annealing
Incubate the mixture at 70 °C for 5 min and place it at room temperature for 5 min if using specific primer or on ice if using Oligo-dT or Random primer.
Preparation of the RT-PCR Mix
Add the following components to the RNA template and primer mix and mix by pipetting gently up and down.
Component | Stock conc. | Final conc. | 20 µl assay |
SCRIPT RT buffer complete | 5x | 1x | 4 µl |
DTT stock solution | 100 mM | 5 mM | 1 µl |
RNAse Inhibitor | 40 units / µl | 40 units | 1 µl |
dNTP mix | 10 mM each | 500 µM each | 1 µl |
SCRIPT RT Enzyme | 200 units/µl | 100 units | 0,5 µL |
- Adding of up to 5 mM DTT may increase the yield and is recommended for individual optimization.
- Addition of 20-40 units RNase inhibitor per assay is recommended and may be essential when working with low amounts of starting RNA. NOT PROVIDED in this kit.
- 100 units (0,5 µl) of enzyme is recommended for standard assays but increasing the amount of enzyme to 200 units (1 µl) per assay may show even higher transcription yields under selected assay conditions.
2. First-strand cDNA synthesis:
- Place the vials in a PCR cycler and start the following program.
- Incubate the reaction mix at 55 ºC for 30-60 min if using gene-specific primers. If using Oligo-dT or Random primers incubate at 42 ºC for 10 min followed by incubation at 55 ºC for 30-60 min.
Step | Temp. | Time |
Reverse transcription1 | 55 ºC | 30-60 min |
Inactivation of RT2 | 70 ºC | 10 min |
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